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关键词：测定 的测定 大肠 大肠菌群 总大肠菌群
多管发酵法
二、 方法依据
三、 测定范围
四、测定原理
总大肠菌群系指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，具有指示菌的一般特征，故以此作为粪便污染指标评价饮水的卫生质量。
水中总大肠菌数系以100mL水样中污染的总大肠菌群最可能数（MPN）表示。
五、试剂
1、乳糖蛋白胨培养液
1.1成份
A 蛋白胨 10g
B 牛肉膏 3g
C 乳糖 5g
D 氯化钠 5g
E 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL
F 蒸馏水 1000mL
1.2制法
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4，再加入1mL溴甲酚紫乙醇溶液（16g/L），充分混匀，分装于装有倒管的试管中，115℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。
2、二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液
按上述乳糖蛋白胨培养液除蒸馏水外，其它成份量加倍。
3、伊红美蓝培养基
3.1成份
A 蛋白胨 10g
B 乳糖 3g
C 磷酸氢二钾 5g
D 琼脂 5g
E 蒸馏水 1000mL
F 伊红水溶液(20g/L) 20mL
G 美蓝水溶液(5g/L) 13mL
3.2制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH为7.2，加入乳糖，混匀后分装，以115℃ 高压灭菌20min。临用时加热熔化琼脂，冷至50~55℃，加入伊红和美蓝溶液，混匀，倾注平皿。
4、革兰氏染色液
4.1结晶紫染色液
A. 成份
a结晶紫 1g
b乙醇[ p （C2H2OH）]=95% 20mL
c草酸铵水溶液（10g/L） 80mL
B制法：将结晶紫溶于乙醇[ p （C2H2OH）]=95%中，然后与草酸铵溶液混合。
注：结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成份，易出现假阳性。结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。
4.2革兰氏碘液
A成份
碘片 1g
碘化钾 2g
蒸馏水 300mL
B制法：将碘和碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水。
4.3脱色剂：乙醇[ p （C2H2OH）]=95%。
4.4沙黄复染液
A成份
a沙黄 0.25g
b乙醇[ p （C2H2OH）]=95% 10mL
c蒸馏水 90mL
B制法：将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后加入蒸馏水。
注：如沙黄买不到，可用苯酚复红染色液（1+10），作复染液，复染时间为10s。
六、仪器设备
1培养箱：36±1℃
2冰箱：0~4℃
3天平
4显微镜
5平皿：直径为9cm
6试管
7分度吸管：1mL，10mL
8锥形瓶
9小倒管
10载玻片
七、分析步骤
1、检验生活饮用水时，取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1mL水样注入到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL（即0.1mL水样）注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度共接种5管。对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种5份10mL双料培养基，每份接种10mL水样。
2、检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1，1.0,0.01mL甚至0.1，0.01，0.001mL。每个稀释度接种5管，每个水样接种15管。接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1mL接种。每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌分度吸管。
3、将接种管置36±1℃培养箱内，培养24±2h，如所有乳糖蛋白胨培训管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。
4、分离培养
将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36±1℃培养箱内培养18—24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落：
深紫黑色，具有金属光泽的菌落。
紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落。
淡紫红色，中心较深的菌落。
作革兰氏染色、镜检和证实试验。
5、证实试验
经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽胞杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36±1℃培养箱中培养24±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。
八、计算
根据证实为总大肠菌阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL水样中的总大肠菌群MPN值。如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告未检出总大肠菌群。
用5份10mL水样时，各种阳性和阴性结果组合时的MPN
0 0
1 2.2
2 5.1
3 9.2
4 16.0
用5管10mL，5管1mL，5管0.1mL，阳性及阴性结果不同组合的MPN
5个管每 5个管每 5个管每 MPN 5个管每 5个管每 5个管每 MPN
管10mL 管1mL 管0.1mL 管10mL 管1mL 管0.1mL
0 0 0 <2 4 2 1 26
0 0 1 2 4 3 0 27
0 1 0 2 4 3 1 33
0 2 0 4 4 4 0 34
1 0 0 2 5 0 0 23
1 0 1 4 5 0 1 31
1 1 0 4 5 0 2 43
1 1 1 6 5 1 0 33
1 2 0 6 5 1 1 46
2 0 0 5 5 1 2 63
2 0 1 7 5 2 0 49
2 1 0 7 5 2 1 70
2 1 1 9 5 2 2 94
2 2 0 9 5 3 0 79
2 3 0 12 5 3 1 109
3 0 0 8 5 3 2 140
3 0 1 11 5 3 3 180
3 1 0 11 5 4 0 130
3 1 1 14 5 4 1 172
3 2 0 14 5 4 2 220
3 2 1 17 5 4 3 220
3 3 0 17 5 4 4 350
4 0 0 13 5 5 0 240
4 0 1 17 5 5 1 350
4 1 0 17 5 5 2 540
4 1 1 21 5 5 3 920
4 1 2 26 5 5 4 1600
4 2 0 22 5 5 5 >1600
九、附《水质细菌学多管发酵法检验报告》
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