关键词：硝酸盐    亚硝酸盐    光谱法

 

亚硝酸盐是潜在的致癌物质，人体摄入的硝酸盐含量过高可能使血液中的变性蛋白增加。在环境监测中，硝酸盐和亚硝酸盐是重要的分析项目。光谱法测定NO₃^--N、NO₂^--N 是最常用、最普通的方法，容易满足测定要求，且限制较少。本文通过对多种硝酸盐、亚硝酸盐的光谱测定法（分光光度法、化学发光法、荧光法、催化动力学法、红外线法、电子顺磁共振法等）进行评价，指出了不同光谱法的优点及其适用范围的限定，并推荐了几种典型的、有代表性的硝酸盐、亚硝酸盐的光谱测定法。

 

2.1可见分光光度法

光谱法中最常用的测定亚硝酸盐的方法是Griess法。NO^2-在酸性条件下与偶氮反应生成红色的偶氮苯，偶氮在500～600nm有最大吸收光谱（若所选择的反应物不同，最大吸收光谱也有所不同）。目前，使用得最多的反应剂是磺胺和N-1-盐酸奈乙二胺，在540nm处比色测定。因所选择的反应剂不同，Griess 法的测定极限是0.02～2μmol/L。Griess法测定NO^2-具有高灵敏性、高准确度和再现性的特点，且方法简单有效，但在复杂介质中测定会受到影响。用Griess法测定NO^3-时，必须先将NO^3-还原为NO^2-，再用Griess法测定NO^2-的含量。

近年来，许多学者对Griess法进行了改进，使其操作更为简便，灵敏性更高。姚庆祯等^[1]采用超声波振荡法，并对锌－镉法测定硝酸盐的试验条件进行了改进，方法的精密度和回收率都较好，可用于江河水、雨水、海水等天然水体中硝酸盐的测定。周本军等^[2]采用固体格氏试剂快速测定水中的亚硝酸盐氮，与液体试剂法相比效果相同，且固体格氏试剂法简化了操作手续，减轻了工作人员的工作强度，降低了分析成本，减少了试剂损耗，另外，配成的固体试剂可长期保存，随时可以适用，更适合大批水样的测定。王海鹰等^[3]采用自行设计的低频振荡还原仪，可在8min还原100个样液，而且还原效率高，操作简便，大大提高了测定的速度，具有重要推广价值。张霞等^[4]用H酸（1，8-氨基萘酚-3，6-二磺酸）代替α-萘胺或盐酸萘乙二胺作为重氮化合物的偶联试剂测定水中亚硝酸盐，亚硝酸盐在0.025～1.0μg /mL范围内呈线性关系。Xu 等^[5]用改进的E.大肠杆菌膜－Griess反应微量滴定板法测定基质中微量硝酸盐。微量滴定板法和常规的可见分光光度法相比有其优势：样品量大、样品容积小、消耗的反应剂少、测定效率高；且其使用的还原剂具有专一性（专一还原硝酸盐）,试验材料没有健康的危险,废物没有损害、伤害等优点。E.大肠杆菌膜还原法已经成功地应用于植物、土壤和水中硝酸盐的测定。Wang等^[6]探讨了用柱式浓缩分光光度法同时测定水、蔬菜样品中的硝酸盐和亚硝酸盐。此方法灵敏性、选择性高，而且准确性高、简单，可同时测定硝酸盐和亚硝酸盐。任志刚等^[7]增大比色皿宽度，将原用3cm改为5cm比色皿，增大了低浓度样品与空白样的差值，提高了方法的灵敏度。

与此同时，液相色谱和连续流动分析与Griess法相结合，拓宽了硝酸盐测定的样品多样性，使其能够测定一些更为复杂样品中的硝酸盐，例如生物液体、食品中的硝酸盐，这是分光光度法研究中的一个新的热点。Kazemzadeh等^[8]使用连续流动分光光度法同时测定多种样品中的硝酸盐和亚硝酸盐，亚硝酸盐和硝酸盐测定的范围分别为0.003～2.00μg /mL、0.030～2.00μg /mL，每小时可测20±3个样品，其测定的极限分别为0.001μg /mL、0.010μg /mL，对水样中、食品样品中硝酸盐、亚硝酸盐的测定取得了满意的结果，这个方法简单、快速、灵敏度高。Legnereová等^[9]依靠连续注射分析法全自动同时测定表层水样的硝酸盐和亚硝酸盐，发现SIA法（Sequential Injection Analysis）与FIA法（Flow Injection Analysis）相比，前者能够测定的样品浓度范围大，并且是全自动分析，准确度和精密度高；与其他方法相比，消耗的反应液和样品量小；另还有一个优点是纤维光学探测器小，可用在便携式测定中。 Petsul等^[10]用微流注射分析法(µFIA)测定硝酸盐。NO^3-的测定极限为0.026μg /mL，在0.5～20µmol/L范围内，相关系数为0.985。流动分析还可与其他比色法相结合，测定硝酸盐与亚硝酸盐。Kazemzadeh等^[11]依据亚硝酸盐与番红O反应形成重盐，重盐引起桔红色的溶液在酸性介质中变成蓝色，在520nm处有吸收光谱。亚硝酸盐和硝酸盐的测定范围分别是0.0001～3.00μg /mL和0.005～3.40μg /mL，测定的极限分别为0.5n g /mL和3n g /mL，用此种方法测定食品中硝酸盐和亚硝酸盐取得了满意的结果。Monser等^[12]利用在加入亚硝酸盐条件下，磷钼蓝蓝色化合物衰减，并且减少的吸收光谱可在820nm处测定，引入了流动注射分析方法同时测定硝酸盐和亚硝酸盐。亚硝酸盐在0.05～1.15μg /mL范围内，硝酸盐在0.06～1.6μg /mL范围内呈线性关系，测定的极限分别为0.01μg /mL和0.025μg /mL。此方法快速、简单，并且不受pH值限制。

Zatar等^[13]提出了利用磷钼蓝络合物用分光光度法测定硝酸盐和亚硝酸盐的一种新方法。这个方法依赖于通过硫化钠还原磷钼酸，形成的磷钼蓝化合物与加入的亚硝酸盐偶氮化，引起蓝色吸收光谱的减少，减少的程度与加入的亚硝酸盐的量成正比，然后在814nm处测定蓝色络合物的吸收光谱。这个方法可用来测定水、肉制品、蔬菜中的硝酸盐（先用Jones还原器还原）和亚硝酸盐，具有测定时间短、测定浓度低的特点。亚硝酸盐与原黄素在酸性条件下反应生成稳定的紫红色化合物，在328nm处有最大吸收光谱，最小的测定极限是2nmol/L。然而，当Fe³⁺超过1mg /L时会对颜色的稳定性有很大的影响，类似的问题也出现在酚醛塑料（苯酚、间苯二酚、间苯三酚）作为指示剂时^[14、15]。丘星初^[16]研究了在硫酸介质中，邻氨基苯甲酸与NO^3-和NO^2-离子显色体系的光度性质与形成条件，显色产物最大吸收波长为560～565nm，符合比耳定律的浓度范围NO^2--N 为0.03～0.15μg /mL，NO^3--N 为0.05~0.20μg /mL, 应用于地表水中硝酸盐和亚硝酸盐的联合测定。关虹等^[17]研究了NO^2-藏红T显色体系及其光度特性，用来测定地面水和污水中的亚硝酸盐氮。该方法线性范围为0.0～3.5μg /mL，检出限为0.88μg /mL，含亚硝酸盐氮1.0μg /mL时相对标准偏差为4.2%。该方法选择性高、反应灵敏，准确度和精密度良好，试剂稳定且无毒性，操作简便，易于推广应用，是测定亚硝酸盐氮的一个较有实用价值的分光光度法。

2.2 紫外分光光度法

张金华^[18]改进了常规紫外分光光度法测定水中硝酸盐氮的操作方法，用活性炭代替树脂吸附处理样品，简化了预处理手续，使测定硝酸盐氮检出限达到0.014m g /mL。方力等^[19]提出了一种神经网络参数优化方法，并成功地将其应用于水中NO^3-和NO^2-的分析，在含量变化较大（最大与最小相差15倍）的范围内对2种物质同时进行测定，硝酸盐氮的相对误差小于5%，亚硝酸盐氮的相对误差略大，但一般小于10%，RSD小于5%。王心宇等^[20]利用紫外检测－离子色谱法测定食品中的亚硝酸盐和硝酸盐，NO^2--N、NO^3--N的检出限分别为4μg /L和10μg /L，此方法适用于测定肉制品、奶粉、蔬菜中的硝酸盐和亚硝酸盐。Lanoul等^[21]采用紫外共振拉曼光谱法同时测定污水处理过程中的硝酸盐和亚硝酸盐，该方法的浓度范围是7μM～3.5mM，是一种较为理想的同时测定污水中硝酸盐和亚硝酸盐的方法。李密等^[22]应用FABMS、NMR、IR、HPLC和紫外分光光谱研究了室温下三乙醇胺与较高浓度NO₂的反应情况，证明反应产物为三乙醇胺硝酸盐和三乙醇胺亚硝酸盐，提出了可能的反应机理，为TEA法监测空气中NO₂的浓度提供了依据。李党生等^[23，24]研究了碱性品红与亚硝酸根在硫酸（或盐酸）介质中的反应，建立了测定亚硝酸盐氮的新方法。该方法的线性范围为0～1.6μg /mL，用于地表水、地下水的测定，结果与盐酸奈乙二胺比色法一致。

导数法与紫外分光光度法相结合，拓宽了紫外分光光度法测定硝酸盐和亚硝酸盐的领域，且其灵敏度高，简便、快速。李萍等^[25]研究了硝酸盐和亚硝酸盐的一阶导数光谱，用一阶导数紫外分光光度法直接测定水中硝酸盐，最低检出浓度为1n g /mL。该方法不需任何分离、掩蔽或转化，直接测定水中NO^3-，简便、灵敏、精密度和准确度较高，适用于饮用水、湖水和河水中NO^3-的测定。戈早川等^[26]将通用标准加入法和偏最小二乘法相结合，提出了一种新的直接同时测定卤肉制品中NO^2-、NO^3-的紫外导数分光光度法。该方法的吸收光谱与常规吸收光谱比较，有较大的红移，可消除或减少卤肉制品中杂质成分的干扰，且灵敏度高，简便、快速、准确、实用。黄志勇、邓满萍^[27]用比光谱导数法同时测定光谱重叠严重的肉制品中NO^3-和NO^2-含量，在不需分离和掩蔽的条件下，测得的回收率和精确度均较高，并且二者的浓度分别在0～9mg /L和0～9mg /L之间符合线性关系，回归的相关系数r均达0.999以上。

Finch等^[28]研究了低能量下紫外分光光度法测定海水中硝酸盐氮。通过快速的1Hz反应，在220nm处测定溶解的硝酸盐氮浓度、海水盐度，同时还可测定溶解的有机物，其典型的能量消耗为3～4W。近年来，第二衍生光波紫外/可见光度法测定硝酸盐的研究颇多，成为紫外分光光度法中的一个新亮点。Simal等^[29]提出了依靠第二衍生光波紫外/可见光度法测定硝酸盐。Suzuki N 和Kurode R^[30]用第二衍生紫外分光光度法同时测定硝酸盐和亚硝酸盐。Crumpton等^[31]修改了第二衍生光谱法，除可以测定硝酸盐外，还可测定有机氮。Ferree等^[32]对第二衍生紫外/可见光谱法测定污水样品中硝酸盐和总氮进行了评价，认为这种方法简便、快速，并且需要的样品量小，而且产生的污染少。Rozan等^[33]开发了一种离子色谱/紫外分光法，可同时测定咸水中的亚硝酸盐、硝酸盐、硫酸盐浓度，并且不需要对样品进行预处理，同时样品需要量少（小于100μL），咸水中的其他一些离子、溴化物和碘化物也可用这个方法测定，只不过在分析前要求对样品进行过滤处理。

 

荧光光度法灵敏度高，近年来对荧光光度法测定NO^2-和NO^3-的研究逐渐增多。杨景和等^[34]用硫酸肼做还原剂，研究了将NO^3-还原为NO^2-的条件，提出水相中采用DAN为荧光剂测定NO^2-和NO^3-的方法，该法在0～2μg /mL范围内NO^2-与荧光强度呈线性关系，检出限为0.4μg /mL，该法能够测定天然水中NO^3-和NO^2-。李劲松、吴爱东^[35]利用亚硝酸和L-酪氨酸（L-Tyr）的荧光反应对NO^2-进行测定，并对可能的干扰离子进行了详细研究，还对牛奶、肉制品、自来水、泉水中的NO^2-进行了直接测定，效果很好。Masserini 等^[36]通过探测器用荧光法同时测定海水中纳摩尔浓度级的亚硝酸盐、硝酸盐和氨离子，亚硝酸盐、硝酸盐的极限分别为4.6nmol/L 和6.9nmol/L，大大地提高了低浓度测定下的极限，每小时可以测定18个样品。

 

在酸性介质中，NO^2-将K₄[Fe(CN)₆]氧化为K₃[Fe(CN)₆]，在尿酸的增强作用下，鲁米诺－铁氰化钾产生化学发光，从而建立了一种间接测定亚硝酸盐的化学发光分析的新方法。该方法的检出限为5.0×10^-11 g /mL，校准曲线范围为1.0×10^-9 g /mL～1.0×10^-5 g /mL。该方法可应用于水样中亚硝酸盐含量的测定^[37]。邓学良等^[38]基于盐酸介质中I^-与NO^2-反应产生的I₂氧化鲁米诺(Luminol)而产生的化学发光反应，建立了Luminol-I^--NO^2-偶合化学发光体系测定血清中NO^2-的方法。该法NO^2-的线性范围为0.018～300μg /L，检出限为0.026μg /L。

气相化学发光能够较大范围地消除测定气体NO和臭氧带来的影响。通常，亚硝酸盐在酸化的KI还原下能释放NO， NO与臭氧反应，生成激发态的NO₂^*，NO₂^*在600nm以上衰变放出微弱的远红外化学发光。这条路径同样可用作硝酸盐的分析，不过要求更强的还原剂【典型的有Ti（III）】。硝酸盐的含量可通过微分计算。化学发光衰变与连续流动分析相结合，与常规紫外/可见光度法相比，提高了测定的极限（10nmol/L），而且方便了大量样品的硝酸盐、亚硝酸盐、铵态氮的测定，所用时间不到3min。然而，该方法明显不足是：提高了系统的复杂性，要求燃烧的温度高（600℃）^[39-41]。

 

门瑞芝等^[42]研究了甲基橙动力学法测定水、食品和蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐，在紫外光照射下甲基橙褪色程度与硝酸盐和亚硝酸盐含量均成正比，该法首先测定二者的总量，然后在氨基磺酸存在下测定硝酸盐的量，再差减求得亚硝酸盐的量。工作曲线范围0.0～1.6μg /mL NO^3-（或NO^2-）。冯枫等^[43]提出催化动力学光度法测定亚硝酸盐的新方法，在酸性介质中，亚硝酸盐具有溴酸盐氧化甲哌氯丙嗪的作用，采用固定时间测定体系的吸光度值，用于水中NO^2-测定，灵敏度高、选择性好，NO^2-浓度在0～70μg /L范围内呈线性关系。牛建平^[44]利用在碘化物存在下的稀硝酸溶液中，亚硝酸根对硫氰酸铁（III）红色络合物的褪色反应所具有的催化作用，采用固定时间法，于460nm波长比色定量测定水中的痕量亚硝酸盐。该方法在0.10～1.00μg /L的线性范围内，样品的变异系数为3.6%～4.5%，回收率为97.0%～107.0%，具有较好的精密度与准确度。袁亚莉等^[45]用镉柱将NO^3-还原为NO^2-，利用在磷酸介质中NO^2-对溴酸钾氧化亚甲蓝这一褪色反应具有强烈的催化作用而建立了同时测定痕量硝酸盐和亚硝酸盐的新方法。该方法简便、快速、灵敏，对硝酸盐和亚硝酸盐的线性范围分别为0～200μg /L和0.003～310μg /L，用于测定各种水样中痕量NO^3-和NO^2-的含量，均获得了满意结果。蒋治良等^[46]将催化法与极谱分析法相结合，建立了催化反应－极谱法。该方法基于在0.016mol/LH₂SO₄中及加热条件下，NO^2-对BrO^3-氧化甲基红有强烈的催化作用，藉自来水冷却中止反应，以NaOH作示波极谱测量指示组分甲基红（Ep=-0.56V, υs, SCE）的支持电解质，建立了NO^2-的第1个催化反应——示波极谱分析法，该法检出限为0.035ng/mL，测定范围为0.1～50 ng/mL。

 

傅立叶远红外光谱法^[47]用来检测气溶胶中的硝酸根离子，在1384 cm^-1和2430cm^-1处有吸收光谱。Yordanov等^[48]依据在有氧条件下，硝酸根离子与亚硝酸根离子有选择地反应，生成一种可化学计算的EPR(电子顺磁共振)－活性单硝基二乙二硫代氨基甲酸盐，氮一氧化物、氮二氧化物在空气中有同样的反应，测定的极限与其在空气中的背景浓度有关。EPR的线性关系NO^2-可达250μg/mL, NO^3-可达16000μg/mL，具有高选择性和高灵敏性的特点。

 

综上所述，硝酸盐和亚硝酸盐光谱测定法日益增多。吸光光度法所用仪器设备简单、价廉，灵敏度也较高，其研究方法具有实用性和可操作性，易于在基层单位使用。近年来连续流动分析技术的发展，分光光度法与连续流动分析技术相结合，大大提高了方法的灵敏度，可同时测定硝酸盐和亚硝酸盐，操作更为简便、快速，消耗的反应液和样品量小，已成为光谱分析法研究的一个新热点，具有广泛的前景。紫外分光光度法的优点是不经分离可直接同时测定硝酸盐和亚硝酸盐，具有较好的选择性，操作简便。一阶导数紫外分光光度法和第二衍生光波紫外/可见光谱法已成为近年来紫外分析法中研究的新热点，拓宽了紫外分光光度法研究的领域。催化动力学法近年来发展较快，应用广泛，检测限一般可达10^-2ng/mL，可直接测定样品中痕量硝酸盐和亚硝酸盐。荧光法、化学发光法、红外线法、分子腔释放法、电子顺磁共振法对仪器的要求较高，但其测定的灵敏度高，在某些方面的开发应用也具有良好的前景。

 

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第一作者许超，男，1978年生，毕业于浙江大学，硕士。